退火温度是影响PCR反应特异性的重要因素。
引物与模板复性所需要的退火温度取决于引物的长度、碱基组成及其浓度。引物长度越短，引物中G+C的含量越低，所需的退火温度越低。虽然降低退火温度可能增加扩增产量，但引物与模板间的错配现象也会增多，导致非特异性扩增上升。
相反，提高退火温度虽然可以提高反应的特异性，但会引起扩增效率下降，甚至无扩增产物出现。引物的退火温度可以通过Tm=4(G+C)+2(A+T)公式组略估算，一般在算出的Tm值上减去5摄氏度极为较合适反应设计退火温度。

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